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详谈各种酶活检测方法
  • 发布日期:2019-03-05      浏览次数:81
    • 详谈各种酶活检测方法

      通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价,它可以用来筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的zui佳组方及确定产品的zui佳添加量等,酶制剂实验室评价技术是目前饲料厂家应用zui为广泛的一种方法。其操作相对简单,检测所用时间短,便于生产实践应用。酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果,但通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。我国饲料工业标准中已经确立了饲用植酸酶(GB/T 18634)、纤维素酶(NY/T912)、β-葡聚糖酶(NY/T 911)的测定方法。另外,许多企事业单位为了生产研究的需要也制定了很多用于各种酶制剂活力的测定方法。目前测定酶制剂活性的方法主要有:

      1, 比色法

          比色法是以反应生成有色化合物的显色反应为基础,通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法,根据原理不同可分为还原糖法和色原底物法。

      2, 还原糖法    这种方法是通过酶作用于化学合成或从自然界提取出来的底物来进行测定的。非淀粉多糖酶与底物在特定的条件(温度、pH值和底物浓度)下反应,反应产物为还原糖,在与显色剂反应后,通过比色确定还原糖的生成量,同时制作标准曲线。酶的活性表示为单位时间产生一定浓度的产物所需要的酶量(mg 或mL)。该法可适用于大部分酶活力的测定,如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶等的测定。根据显色剂的不同又可分为DNS 法、钒钼酸铵法和地衣酚法。其中DNS 法由于操作简单、显色稳定,是目前众多实验室和饲料企业在测定非淀粉多糖酶时应用zui多的测定方法。

      3, 色原底物法    原理是利用人工合成的含色原基团的底物在酶的作用下释放出有色物质,利用分光光度计比色测定有色物质的含量计算酶活。如木聚糖酶活力的测定。该法操作简单、重现性好,但酶作用于合成底物与天然底物的效果有一定区别,用合成底物测定的酶活并不能代表酶制剂在应用于天然饲料时所能发挥的酶活大小。

      4,  黏度法

          这种方法是根据酶能够降低一定浓度的标准底物(控制pH值、温度等条件)的黏度的能力来确定酶的活性。利用的底物主要有化学合成的底物(如CMC 用于纤维素酶的测定) 和自然提取的底物(如小麦阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的测定)。测定的酶的活性值是通过与同时测定的标准酶活性的比较,来确定酶的活性。该法可用于木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶等酶活测定。这种方法的特点是通过降低底物的粘度来反映酶的活性,这也正是酶在体内起作用的重要特征。该法虽然灵敏度较高,但重现性差,操作复杂费时,应用难于普及。

      5,  免疫学法

          用于酶活性分析的免疫学法包括ELISA 法和免疫凝胶扩散法。这两种方法是根据酶与抗体之间发生反应,然后ELISA 法通过第二步反应,凝胶扩散法则通过印染过程来确定酶的活性。

          这些方法非常灵敏,能够检测到极低水平的酶蛋白。但它们的缺点是对于每个产品的酶需要特殊的抗体,另外抗体能够与非酶蛋白质发生反应。由于抗体本身所用的蛋白质是特定的,因此,由不同生产者生产的同种类型的酶之间是没有交叉性的。另外,采用实验动物的敏感性也值得探讨。

      6,  凝胶扩散法

          这种方法是将酶作用的底物与某种凝胶混合后倒入培养皿中,凝固之后,在凝胶上切开一条凿,倒入标准酶液和测试酶液。培养一定时间后,在切开的凝胶周围能够看到水解区域,区域的大小与酶的含量成正比。在某些情况下,还可以再加入其他试剂来显示水解的区域。如木聚糖酶活力的测定。    这种方法虽然简单,但培养时间长。因为这种方法是根据区域的大小来确定酶的活性,所以其准确性要低于其他非扩散的方法。

      7,  比浊法

          以酵母或酵母细胞壁在缓冲溶液中的浊度或吸光度的降低来表示酶活力,如β-葡聚糖酶活力的测定。

      8,体外模拟消化技术

          酶活测定毕竟不能反映外源酶在机体内真实的作用效果,因此,对于体外法评定饲料营养价值的研究不断增加。体外法评定饲料营养价值是通过模拟消化道内温度、pH、消化酶分泌、胃肠运动和养分吸收等参数,在体外建立一套与畜禽消化道内环境接近的操作程序,对饲料及酶制剂进行营养价值预测和评定。常用的体外模拟消化技术包括:胃蛋白酶—胰酶法;胃蛋白酶—小肠液法;胃蛋白酶—胰酶—瘤胃液法;胃蛋白酶—胰酶—碳水化合物酶法。

          由于不同的饲料用酶是不同的微生物通过发酵过程产生的,酶产品的酶学性质差别较大。并且各种微生物所分泌的酶的zui佳pH 值、温度和对底物的亲和性都不相同。而目前,饲用酶除植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶有正式颁布的国标或行标酶活测定方法外,其他饲用酶制剂目前都还没有一个统一的定义及检测标准。因此,饲料厂家在比较不同厂家的酶制剂时,在没有统一的测定方法情况下,应首先确定自己认可的检测方法,然后在完全相同的测定条件进行检测,这样得出的结论才具有可比性。

       

       

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